การย้อมสีแกรม
ผู้ที่คิดค้นการย้อมสีวิธีนี้คือ Hans Christian Gram ในปี คศ. 1884 ผลของการย้อมสีแกรมทำให้จำแนกแบคทีเรียออกได้ 2 กลุ่ม คือ
1. แกรมบวก (Gram Positive) แบคทีเรียที่ย้อมติดสีน้ำเงินม่วง
2. แกรมลบ (Gram Negative) แบคทีเรียที่ย้อมติดสีแดง
สีและสารละลายที่ใช้ทั้งหมด
1. Crystal violet
2. สารละลายไอโอดีน
3. เอทธิลแอลกอฮอล์ 95%
4. Safranin
5. น้ำกลั่น
วิธีการย้อมแกรม
1. smear เชื้อที่ต้องการย้อมลงบนสไลด์ที่สะอาด ทิ้งให้แห้ง จากนั้นตรึงตัวเซลล์ด้วยการผ่านเปลวไฟ (ระวังเซลล์จะแตกตายก่อนด้วย) การตรึงเซลล์จะช่วยให้เซลล์แห้งติดกับแผ่นกระจกสไลด์
2. หยด Ammonium oxalate crystal violet บนเชื้อที่ smear นานประมาณ 1 - 2 นาที แล้วเทสีทิ้ง
3. หยดสารละลายไอโอดีนตามลงไปนานประมาณ 2 นาที แล้วเททิ้ง สารละลายไอโอดีนจะช่วยให้เซลล์ย้อมติดสีได้ดีขึ้น
4. ขั้นตอนนี้เรียกว่า Decolorized โดยการล้างสีด้วยเอทิลแอลกอฮอล์ 95% นาน 30 วินาที แล้วจึงตามด้วยน้ำกลั่น
5. หยดสีSafraninบนเชื้อนานประมาณ 15-30 วินาที ล้างสีด้วยน้ำ แล้วจึงมองเซลล์ผ่านทางกล้องจุลทรรศน์
ลักษณะการเปลี่ยนแปลงระหว่างการย้อมแกรมของแบคทีเรีย
สีและสารละลายที่ใช้
ปฏิกิริยาที่เกิดขึ้น
แบคทีเรียแกรมบวก
แบคทีเรียแกรมลบ
1.Ammonium oxalate crystal violet
เซลล์ติดสีม่วง
เซลล์ติดสีม่วง
2. สารละลายไอโอดีน
สารละลายไอโอดีนรวมกับ crystal violet เป็นสารประกอบที่มีโมเลกุลขนาดใหญ่ ภายในเซลล์ยังติดสีม่วง
สารละลายไอโอดีนรวมกับ crystal violet เป็นสารประกอบที่มีโมเลกุลขนาดใหญ่ ภายในเซลล์ยังติดสีม่วง
3. เอทธิลแอลกอฮอล์ 95%
ไซโตพลาสซึมและผนังเซลล์สูญเสียน้ำ จึงเกิดการเหี่ยวหรือหดตัว ทำให้รูของผนังเซลล์มีขนาดเล็ก สารประกอบของสีซึ่งมีโมเลกุลชนาดใหญ่ไม่สามารถละลายออกมาได้ เซลล์จึงติดสีม่วง
สารพวกลิปิดที่ผนังเซลล์ถูกละลายออกไป ทำให้รูของผนังเซลล์มีขนาดใหญ่ขึ้น สารละลายของสีจึงสามารถละลายออกจากเซลล์ได้ เซลล์ไม่ติดสี
4.Safranin
เซลล์ไม่ทำปฏิกิริยากับสีนี้ เซลล์ติดสีม่วง ตามเดิม
เซลล์ติดสีแดง ของSafranin
*** เวลาย้อมแกรมระวังสีหยดลงบนโต๊ะที่ทำการทดลอง เพราะขัดล้างไม่ค่อยออก ***
หลักเกณฑ์ในการย้อมแกรม
1. เซลล์ปกติ ( vegetative cell )เท่านั้นที่ติดสีแกรมบวกหรือแกรมลบ แต่ถ้าเซลล์เกิดแตกขึ้นมาจะติดสีเฉพาะแกรมลบเท่านั้น
2. การย้อมแกรมต้องใช้ crystal violet และสารละลายไอโอดีนเสมอ
3. แบคทีเรียเท่านั้นที่ให้ผลต่างกันในการย้อมแกรม แต่จุลินทรีย์ชนิดอื่นๆ จะติดสีย้อมแกรมอย่างใดอย่างหนึ่งเท่านั้น เช่น เซลล์ยีสต์จะติดสีแกรมบวก
4. การย้อมสีแกรมสามารถเปลี่ยนแบคทีเรียแกรมบวกเป็นแกรมลบได้ แต่สามารถเปลี่ยนแบคทีเรียแกรมลบไปเป็นแกรมบวกได้
5. ไซโตพลาสซึมติดสีแกรมลบเท่านั้น
6. แบคทีเรียแกรมบวกถูกล้างสียากกว่าแกรมลบ
7. สปอร์ที่ยังไม่เจริญเต็มที่ ( immature endospore) จะติดสีแกรมบวก ส่วนสปอร์ที่เจริญเต็มที่ ( mature endospore) ไม่ติดสีแกรม
การเตรียมสีในการย้อมแกรม
1. Ammonium oxalate crystal violet
เราจะต้องเตรียมสารละลาย Gram's crystal violet และAmmonium oxalate ผสมเข้าด้วยกัน โดยวิธีการเตรียมทำตามขั้นตอนต่อไปนี้
1.1 เตรียม Gram's crystal violet
- Crystal violet 2.0 กรัม
- เอทธิลแอลกอฮอล์ 20.0 มิลลิลิตร
ให้ทำการละลาย Crystal violet ในเอทธิลแอลกอฮอล์
1.2 เตรียม Ammonium oxalate
- Ammonium oxalate , C.P 0.8 กรัม
- น้ำกลั่น 80.0 มิลลิลิตร
ละลาย Ammonium oxalate ในน้ำกลั่น
เมื่อได้ทั้ง Gram's crystal violet และ Ammonium oxalate แล้ว จากนั้นให้ผสมสารละลายทั้งสองเข้าด้วยกันและคนให้เข้ากัน
2. สารละลายไอโอดีน
- Iodine , C.P 1.0 กรัม
- Potassium Iodide, C.P ( KI ) 2.0 กรัม
- น้ำกลั่น 300.0 มิลลิลิตร
ผสม Iodine และ Potassium Iodide ในโกร่ง ใช้สากบดให้ละเอียด แล้วจึงค่อยๆเติมน้ำกลั่นลงไป ผสมให้เป็นเนื้อเดียวกับน้ำน้ำกลั่น
3. Safranin
- Safranin 0.25 กรัม
- เอทิลแอลกอฮอล์ 10.00 มิลลิลิตร
- น้ำกลั่น 100.00 มิลลิลิตร
ละลาย Safranin ในเอทธิลแอลกอฮอล์ แล้วจึงเติมน้ำกลั่น และทำการคนให้เข้ากัน จากนั้นจีงกรองผ่านกระดาษกรองเอาแต่ส่วนที่เป็นของเหลวสีแดงไปใช้
สุดท้ายก่อนจบ มาดูวิดิโอการย้อมแกรมประกอบเพื่อทำความเข้าใจ และเห็นภาพในการปฏิบัติงานจริง
การย้อมแกรมเป็นเทคนิคในการศึกษาจุลินทรีย์ โดยดูสีที่ย้อมติดกับตัวจุลินทรีย์ลักษณะการย้อมติดที่ตัวเซลล์เป็นแบบ differential strain ซึ่งเป็นการใช้สีย้อมมากกว่าหนึ่งชนิด สีจะติดตามไซโตพลาสซิมและผนังเซลล์ทำให้เห็นความแตกต่างระหว่างเซลล์แบคทีเรียชนิดต่างๆ ได้
คอมเมนต์
Bacillus subtilis เป็นแบคทีเรียแกรมบวก ผลทดสอบcatalaseเป็นบวก มีflagellaแบบperitrichous สามารถสร้างcapsuleได้ อยู่ในกลุ่มobligate aerobe สามารถสร้างendosporeซึ่งเป็นโครงสร้างที่มีความทนทานต่อสภาวะแวดล้อมที่ไม่เหมาะสมต่อการเจริญได้ดี แหล่งที่อยู่อาศัยพบได้ทั่วไปในดิน
ประวะติ
เดิมถูกเรียกว่าVibrio subtilisโดยChristian Gottfried Ehrenbergในปีค.ศ.1835 ต่อมาในปีค.ศ. 1872ได้เปลี่ยนชื่อเป็นBacillus subtilisโดยFerdinand Cohn และในปีค.ศ.1966U.S. Army's Special Operations Divisionได้นำเชื้อชนิดนี้มาใช้ทดลองเกี่ยวกับสงครามชีวภาพ
เวลา00:41 วันที่ 10 -11 -2009 อ้างอิง
สืบพันธุ์โดยการแบ่งเซลล์จากหนึ่งเป็นสอง(binary fission) โดยการแบ่งเป็นแบบไม่สมมาตร นอกจากนี้ยังพบว่า เมื่อมีสภาวะในการเจริญที่ไม่เหมาะสม เช่น ขาดอาหาร หรือขาดน้ำ แบคทีเรียชนิดนี้จะมีการสร้างendosporeซึ่งเป็นโครง สร้างพิเศษที่มีความทนทานต่อสภาวะแวดล้อมที่ไม่เหมาะสมต่อการเจริญนั้นได้ เป็นระยะเวลานาน และจะงอกออกมาเป็นเซลล์ที่สมบูรณ์ได้เมื่อมีสภาวะเหมาะสมต่อการเจริญอีก ครั้ง ในบางครั้งอาจไม่ถือว่าendosporeเป็นโครงสร้างสืบพันธุ์ เนื่องจากไม่มีการเพิ่มจำนวนของเซลล์
การก่อโรค
ไม่ ถูกพิจารณาว่าเป็นเชื้อก่อโรคในคน แต่อาจก่อโรคได้ในโอกาศที่ยากยิ่งโดยการปนเปื้อนไปกับอาหารแล้วทำให้เกิด อาหารเป็นพิษขึ้น และอาจทำให้แป้งขนมปังเน่าเสียได้
เวลา00:42 วันที่ 10 -11 -2009 อ้างอิง
Bacillus subtilis มีการนำมาใช้ประโยชน์ได้หลายประการ กล่าวคือ สามารถใช้ในการทดลองเรื่องสงครามชีวภาพเป็นประการแรก และยังสามารถใช้เป็นโมเดลการศึกษาในห้องทดลอง นอกจากนี้ยังใช้ในด้านการอาหารซึ่งก็คือ การทำถั่วเน่านั้นเอง เป็นการเพิ่มคุ่นค่าให้กับอาหารและช่วยถนอมอาหารได้ยาวนานยิ่งขึ้น ในด้านการเกษตร B. subtilis strain QST 713 ถูกใช้เป็นตัวควบคุมทางชีวภาพซึ่งมีประสิทธิภาพในการผลิตสารต้านเชื้อรา ในด้านการอุตสาหกรรม Bacillus subtilis สามารถผลิตเอนไซม์ที่ใช้เติมในผงซักผ้าซึ่งใช้กันอยากแพร่หลายในอุตสาหกรรมการผลิตผงซักผ้า นอกจากนั้น recombinants B. subtilis str. pBE2C1 and B. subtilis str. pBE2C1AB ยังถูกใช้ในการผลิต polyhydroxyalkanoates (PHA) ซึ่งสารPHA สามารถนำไปผลิตพลาสติกได้
เวลา00:43 วันที่ 10 -11 -2009 อ้างอิง
Madigan M; Martinko J (editors). (2005). Brock Biology of Microorganisms, 11th ed., Prentice Hall. ISBN 0-13-144329-1.
Nakano MM, Zuber P (1998). "Anaerobic growth of a "strict aerobe" (Bacillus subtilis)". Annu Rev Microbiol 52: 165-90. doi:10.1146/annurev.micro.52.1.165. PubMed.
Ryan KJ, Ray CG (editors) (2004). Sherris Medical Microbiology, 4th ed., McGraw Hill. ISBN 0-8385-8529-9.
Noirot P (2007). "Replication of the Bacillus subtilis chromosome", Bacillus: Cellular and Molecular Biology (Graumann P, ed.). Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-12-7.
Ehrenberg CG (1835). Physikalische Abhandlungen der Koeniglichen Akademie der Wissenschaften zu Berlin aus den Jahren 1833–1835, 145-336.
Cohn F (1872). "Untersuchungen über Bacterien". Beitr Biol Pflanzen 1(Heft 1): 127-224.
เครดิต คุณ วสันต์ ศรีพรม
เวลา00:43 วันที่ 10 -11 -2009 อ้างอิง