Food science, food industrial technology on blog

ถึงเวลาเขียนเรื่องที่ควรจะเขียนตั้งนานแล้วนะครับ ในเรื่องนี้ถือว่า เป็นหัวเรื่องที่นักวิทยาศาสตร์การอาหารทุกคน ต้องมีความรู้ความเข้าใจในเรื่องของธรรมชาติ, กลไกการเกิดสีน้ำตาลเนื่องจากเอนไซม์ในผลิตภัณฑ์อาหาร และเข้าใจว่าทำไมเจ้า "โพลีฟีนอลออกซิเดส" ถึงได้ใจร้ายกับเรานัก การเกิดสีน้ำตาลเนื่องจากเอนไซม์ กลไกการเกิดจะแตกต่างจากการเกิดสีน้ำตาลประเภทก่อนหน้านี้ที่เราเรียกว่า ปฏิกิริยาเมลลาร์ด ซึ่งตัวนั้นสารตั้งต้นก็คือกรดอะมิโน และ น้ำตาลรีดิวซ์ สำหรับการเกิดสีน้ำตาลเนื่องจากเอนไซม์นี้จะเกิดขึ้นได้ทั้งในพืช และเนื้อสัตว์ แล้วเมื่อใดที่มันเกิดสีน้ำตาลขึ้นมากับวัตถุดิบ หรือผลิตภัณฑ์แล้วละก็จะมีผลเสียต่อการยอมรับของผู้บริโภค

เพราะบางครั้งเวลาที่เกิดสีน้ำตาล มันก็จะเกิดขึ้นพร้อมกับการเปลี่ยนแปลงการกายภาพอื่นๆด้วย เช่นการเปลี่ยนแปลงเนื้อสัมผัส สี กลิ่น และรสชาด รวมทั้งทำให้อายุการเก็บรักษาสั้นลงด้วย ดังนั้นบทความนี้ผมก็หวังว่าคงจะมีประโยชน์ต่อการทำความเข้าใจ ในเรื่องการเกิดสีน้ำตาลเนื่องมาจากเอนไซม์นะครับ

การเกิดสีน้ำตาลในผักและผลไม้

ผมว่าทุกคนคงจะพอทราบแล้วว่า ตัวการหลักที่ทำให้เกิดสีน้ำตาลเนื่องจากเอนไซม์ ก็คือ เอนไซม์โพลีฟีนอลออกซิเดส ซึ่งเป็นเอนไซม์ในกลุ่มออกซิโดรีดักเทส(Oxidoreductase) อันเป็นเอนไซม์ที่ทำหน้าที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาออกซิเดชัน-รีดัคชัน  โดยสิ่งที่เอนไซม์ต่างจากสารเมตาบอไลต์อื่นๆ ในสิ่งมีชีวิตก็คือ มันช่างเลือก!! มันมีความจำเพาะเจาะจงสูง สำหรับโพลีฟีนอลออกซิเดส (Polyphenoloxidase) ถ้าดูจากชื่อของมันที่ลงท้ายด้วย -ase เราก็ตีความได้ในเบื้องต้นว่า มันเกิดมาเพื่อทำปฏิกิริยาออกซิเดชันกับสารประกอบฟีนอล แล้วฟีนอลก็คือ สารประกอบอะโรมาติกที่มีหมู่ไฮดรอกซิล ถ้าทุกคนเข้าใจตรงนี้ เราก็จะไปกันได้เร็วแล้วละทีนี้

เมื่อสารประกอบฟีนอล ถูกออกซิเดชัน ก็จะกลายเป็นสารประกอบควิโนน แล้วเมื่อเกิดมะรุมมะตุ้มไปมา สุดท้ายเราจะได้สารประกอบสีน้ำตาลที่เป็นพอลิเมอร์โครงสร้างซับซ้อน หรือที่เราเรียกว่า เมลานิน ที่นี้...แล้วเมื่อไหร่ละที่พืชจะมีการสร้างสีน้ำตาลที่ว่า คำตอบก็คือ เมื่อพืชมันเครียดครับ!! โดยปกติแล้วอะไรทีไม่จำเป็นธรรมชาติย่อมจะไม่สร้างมันขึ้นมา เจ้าเอนไซม์ตัวนี้จะอยู่ในทั่วไปในเซลล์พืช พบทั้งในพลาสมิด, ไซโทพลาสม และคลอโรพลาสต์ มีหน้าที่ร่วมทำปฏิกิริยากับสารประกอบฟีนอล สร้างสารเคมีที่ใช้ป้องกันอันตรายจากจุลินทรีย์ และสิ่งมีชีวิตอื่นๆจากภายนอก อย่างที่เราทราบกันมานะครับว่า สารประกอบฟีนอลบางตัวมีฤทธิ์เป็นสารต้านเชื้อรา เช่น กรดแคฟเฟอิค, กรดคลอโรเจนิค

สารประกอบควิโนนที่เป็นผลมาจากการเกิดออกซิเดชััน ก็เป็นสารประกอบที่มีรสขม เป็นพิษกับแมลง ซึ่งเมื่อมีสารประกอบควิโนนในปริมาณมากเข้าก็จะทำให้เกิดพอลิเมอร์ที่มีสีน้ำตาลดังที่เรารู้จักว่า เมลานิน ซึ่งมีโครงสร้างและมีฤทธิ์ต้านทานจุลินทรีย์อีกด้วย ซึ่งจากที่ผมอธิบายมานี้นะครับ เราจะเห็นว่า กลไกการเกิดสีน้ำตาลจะเกิดกับพืช เมื่อ..พืชอยู่ในสภาวะที่ถูกคุกคามต่อเซลล์ เอนไซม์อื่นๆ ที่มีหน้าที่ป้องกันอันตรายในพืช ก็ได้แก่ ไคติเนส(chitinase), เพอรอกซิเดส(peroxidase), ไลพอกซีจิเนส(lipoxygenase), เฟนิลอะลานีน แอมโมเีนียไลเอส(phenylalanine ammonia lyase) เป็นต้น

ทีนี้ถ้าจะบอกว่าวัตถุดิบไหนก็ตาม ที่มีสารประกอบฟีนอลภายในเซลล์ ไม่ว่าจะเป็น ฟลาโวนอยด์,ไทโรซีน, แคเทซิน,  กรดแคฟเฟอิค, กรดซินนามิค ฯลฯ ก็มีโอกาสที่จะเกิดปฏิกิริยาสีน้ำตาลขึ้นมาได้ทั้งนั้น เมื่อมันถุกคุมคามจากสิ่งแวดล้อมภายนอก และสภาวะอำนวยต่อการเกิดปฏิกิริยา เช่นการปอกเปลือก หรือหล่นกระแทกพื้น ก็ช่วยเร่งให้เกิดสีน้ำตาลขึ้นมาทั้งนั้นละจ๊ะ

การเกิดสีน้ำตาลในผลิตภัณฑ์เนื้อสัตว์

เราพบการเกิดสีน้ำตาลในกุ้ง และบรรดาครัสเตเชียน หลายชนิด โดยเอนไซม์โพลีฟีนอลออกซิเดสที่พบในสัตว์พวกนี้ จะอยู่ในรูปของ zymogen หรือในรูป propolyphenol oxidase  และในทำนองเดียวกับพืช เอนไซม์พวกนี้ ปกติจะถูกเก็บไว้ในไกลโคโปรตีน, ไกลแคน ลามินาริน จะถูกปล่อยออกมาทำงานก็ต่อเมื่อถูกคุมคามจากภายนอก เช่น เมื่อมีจุลินทรีย์เจาะเข้าเซลล์ กลไกการป้องกันของสัตว์ดังกล่าวจะทำการย่อยตัวเอง หรือ phagocytosis เพื่อปล่อย propolyphenol oxidase ออกมาทำปฏิกิริยาสร้างสารเคมีเพื่อต้านจุลินทรีย์

รูปที่ 1 กลไกการป้องกันตัวเอง จากจุลินทรีย์ด้วยโพลีฟีนอลออกซิเดส

ในสิ่งมีชีวิตที่มีเปลือกแข็งหุ้มภายนอก เช่น แมลง และ ครัสเตเชียน เปลือกนอกของมันจะเป็นสารประกอบไคติน ก็จะมีเอนไซม์กลุ่มดังกล่าวอยู่ด้วยในรูปของ propolyphenol oxidase ซึ่งในการศึกษาเกี่ยวกับแมลง ก็มีรายงานว่าระดับของเอนไซม์ขึ้นอยู่กับวัยของตัวแมลง โดยในแมลงระยะเต็มวัยจะมีระดับเอนไซม์สูงกว่าระยะตัวอ่อน เช่นเดียวกับในกุ้ง อันมีรูปแบบการสร้างเปลือกแข็งภายนอกเช่นเดียวกัน

ในเนื้อกุ้งมีรายงานแบบให้คะแนนระดับของการเกิดสีน้ำตาลไว้ สำหรับประเมินคุณภาพ

ตารางที่ 1 ระดับคะแนนการเกิดสีน้ำตาล ที่มีไว้สำหรับอธิบายคุณภาพเนื้อกุ้ง(Adapted from Otwell and Marshall, 1986)

ลักษณะกลไกเฉพาะตัวของโพลีฟีนอลออกซิเดส

สำหรับการเข้าทำของ Polyphenol oxidase จะประกอบด้วยสองปฏิกิริยาร่วมกัน ได้แก่

1)ปฏิกิริยา hydroxylation ในตำแหน่ง o หรือเป็นการเติมหมู่ไฮดรอกซิลเข้าไปยังตำแหน่งที่ติดกับฟังก์ชันแนลกรุ๊ปหลักนั่นเอง พอจะจำกันได้ไหมครับกับคำว่า para, meta, ortho  และ

2) ปฏิกิริยา oxidation เปลี่ยนหมู่ไฮดรอกซิล ให้กลายเป็นคาร์บอนิล เช่นการเปลี่ยน ไดฟีนอล(diphenol) ไปเป็น ออร์โท-เบนโซควิโนน (o-benzoquinones) อ่านตามไปเรื่อยๆนะครับ

ช่วงต่อจากนี้ไปใครที่พื้นฐานเคมีอินทรีย์ดีๆ จะเข้าใจได้โดยง่าย ซึ่งผมเองจะพยายามใช้คำอธิบายพื้นๆที่สุดนะครับ จะได้เข้าใจกันง่ายๆ เผื่อว่าอ่านไประลึกชาติสมัยที่เรียนออเคมกันได้นะจ๊ะ มาดูตัวอย่างเอนไซม์ในกลุ่มฟีนอลออกซิเดสกัน

เอนไซม์โมโนฟีนอล ออกซิเดส (Monophenol oxidase)

จากการอธิบายกลการเข้าทำเบื้องต้นของพวกโพลีฟีนอลออกซิเดสที่มีการเข้าทำปฏิกิริยาสองขั้นตอน เราก็มาดูตัวง่ายสุดก่อนนะครับ เริ่มจากโมโนฟีนอล สำหรับกลไกในรูปที่ 3 สารประกอบโมโนฟีนอลจะถูกเติมหมู่ไฮดรอกซิลที่ตำแหน่งออร์โท ดังนั้นจากเดิมที่เป็น โมโนฟีนอล ก็จะกลายร่างเป็น ออร์โท-ไดฟีนอล ตัวอย่างเอนไซม์พวกนี้ก็เช่น ไทโรซิเนส (tyrosinase)

รูปที่ 3 กลไกการเปลี่ยนแปลงจากโมโนฟีนอลไปเป็นไดฟีนอล

ในทำนองเดียวกันใช่ว่าสารตั้งต้นต้องเริ่มจากสารประกอบฟีนอลแต่เพียงอย่างเดียวเท่านั้น สารประกอบอาโรมาติกเอมีน มีสามารถทำปฏิกิริยาไฮดรอกซิเลชันได้เร็วตามธรรมชาติก็สามารถให้สารประกอบออร์โท-อะมิโนฟีนอลได้

รูปที่ 4 กลไกการเปลี่ยนแปลงของสารประกอบอาโรมาติกเอมีนไปเป็นออร์โท-อะมิโนฟีนอล

เอนไซม์ไดฟีนอล ออกซิเดส (Diphenol oxidase)

การเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันของสารตั้งต้นไดฟีนอล ไปเป็นลิตภัณฑ์อย่างควิโนนจะเกิดขึ้นภายใต้การเร่งของเอนไซม์ ไดฟีนอล ออกซิเดส (diphenol oxidase) ดังรูปที่ 5  ซึ่งการเปลี่ยนแปลงจะเกิดได้ไวกว่า เนื่องจากข้ามช่วงแรกของการไฮดรอกซิเลชันไป ในตัวอย่างรูปที่ 5 เราจะเห็นนะครับว่าหมู่ไฮดรอกซิลทั้งสองตัวอยู่ในตำแหน่งออร์โท ซึ่งกันและกัน ซึ่งการจะเติมหมู่ไฮดรอกซิลเพิ่มอีกในตำแหน่งออร์โท เฉกเช่นสารตั้งต้นที่เป็นโมโนฟีนอลนั้น ในภาวะปกติจะทำไม่ได้ตามหลักการเติมนิวคลีโอไฟล์ลงในวงแหวนอะโรมาติก ไฮดรอกซิลซึ่งมีสภาพเป็นนิวคลีโอไฟล์ ซึ่งถ้าบังคับให้มันเติมจริงๆก้ทำได้ครับ แต่หมู่ไฮดรอกซิลจะเข้าที่ตำแหน่งพารา หรือ เมตา ก่อน

รูปที่ 5 กลไกการเปลี่ยนแปลงจากแคทิคอลไปเป็นออร์โท-เบนโซควิโนน.

อันนี้ง่ายเลยใช่ไหมครับ แคทีคอล ถูกออกซิไดส์ จะได้เป็น ปู เอ้ยย ออร์โทเบนโซควิโนน

รูปที่ 6 กลไกการเปลี่ยนแปลงจากกรดอะมิโนไทโรซีนไปเป็นเมลานิน (Lerner, 1953).

แล้วถ้าเป็นสารตั้งต้นอย่างกรดอะมิโนไทโรซีน... ดูภาพกลไกแล้วอย่าเพิ่งรีบมึนนะครับ มันก็สเตปเทพ สเตปเดิมๆ คือ ถ้าเติมไฮดรอกซิลในตำแหน่งออร์โทได้ ก็จะเติม และหากถ้าเติมไม่ได้ก็จะออกซิไดส์ เริ่มจากไทโรซินจะกลายเป็น ไดไฮดรอกซิลเฟนิลอะลานีน(DOPA) เนื่องจากการเติมหมู่ไฮดรอกซิลเข้าไปในตำแหน่งที่ 4 ติดกับไฮดรอกซิลเดิมในตำแหน่งที่ 3 จากนั้นก็ออกซิไดส์หมู่ไฮดรอกซิลรอบนึงกลายเป็นสารประกอบควิโนน ต่อจากนั้น ลองสังเกตที่หมู่อะมิโนตรงห้าเหลี่ยม เราจะพบว่าปลายมันปิด และที่ตำแหน่ง 3,4 ของ DOPA quinone ก็กลายเป็นหมู่ไฮดรอกซิลขึ้นมาเฉย...  ลองเดาสิครับว่าเกิดอะไรขึ้น มีใครนึกถึงปฏิกิริยารีดิวซ์บ้างเอ่ย แล้วต่อจากนั้นก็จะออกซิเดชันอีกรอบ จากเดิมที่เป็นหมู่ไฮดรอกซิลก็จะกลายเป็นหมู่คาร์บอนิล ได้สารประกอบ Dopachrome 

ปฏิกิริยาอะไรเอ่ยที่ทำให้หมู่คาร์บอนไดออกไซด์หลุดได้... ติ๊กตอกๆๆ คำตอบคือ ปฏิกิริยาดีคาร์บอกซิเลชันครับ ซึ่งจะทำให้สมบัติความเป็นกรดอินทรีย์หายไป แล้วในท้ายที่สุดดด เราก็จะได้สารประกอบเมลานิน ที่มีสีน้ำตาล

ในการเข้าทำของเอนไซม์ phenoloxidase ในบางช่วงนั้น จำเป็นต้องอาศัยโลหะเพื่อเร่งอัตราของปฏิกิริยา คือ ทองแดง

รูปที่ 7 แสดงกลไกแบบง่าย แสดงการเกิด hydroxylation และ oxidation ของไดฟีนอลด้วยเอนไซม์phenoloxidase

เอนไซม์แลคเคส (Laccase)

เอนไซม์แลคเคส หรือ Laccase (p-diphenol oxidase, E.C. 1.10.3.2)(DPO) เป็นเอนไซม์ในกลุ่มออกซิโดรีดักเทสอีกชนิด ที่ตัวมันเองก็มีทองแดงประกอบอยู่ด้วย ทำให้รูปแบบการออกซิไดส์จะแตกต่างไปจากเอนไซม์ฟีนอลออกซิเดสเล็กน้อย ดูรูปที่8ประกอบกันเลยนะครับ

รูปที่ 8 เปรียบเทียบการทำปฏิกิริยาระหว่าง แคทีคอลเลส กับ แลคเคส

ด้านบนซึ่งเป็นสารประกอบออร์โท-ไดฟีนอล(o-diphenol) ที่มีหมู่ไฮดรอกซิล2หมู่ในตำแหน่งออร์โทซึ่งกันและกัน ในขณะที่ด้านล่างเป็นพารา-ไดฟีนอล(p-diphenol) ซึ่งกล่าวโดยสรุปคือ แลคเคสจะเปลี่ยนสารประกอบพารา-ไดฟีนอลไปเป็นพารา-ควิโนน จนได้สารประกอบพอลิเมอร์เมลานินในท้ายที่สุด ในธรรมชาติเราจะพบเอนไซม์แลคเคส มาจากเชื้อราที่อาศัยอยู่กับพืชยืนต้น และผลไม้บางชนิดเช่น แอปริคอท กับ พีชเท่านั้น เราจะไม่พบแลคเคสในผลไม้ และผักอื่นๆ เชื้อราที่มีรายงานว่าให้เอนไซม์แลคเคสก็ได้แก่ Lactarius, Polyporus, Aspergillus, Pleurotus, Polystictus, Psalliota, Glomerella, Podospora, Botrytis, Neurospora และ Russula

ทั้ง Catechol oxidase และ laccase สามารถที่จะเปลี่ยนสารประกอบฟีนอลให้เป็นสารสีน้ำตาลได้ โดยความจำเพาะเจาะจงกับสารตั้งต้นได้แสดงไว้ในตารางที่ 2  โดยที่ความแตกต่างบางอย่างที่น่าสนใจ ได้แก่ สารที่ไม่มีผลยับยั้งอัตราปฏิกิริยาของแลคเคส แต่มีผลกับแคทีคอลเลสได้แก่ คาร์บอนมอนอกไซด์,  phenylhydrazine หรือ 2,3-naphthalenediol ทั้งนี้หากว่าเราต้องการจะยับยั้งการทำงานของแลคเคส ก็ต้องทำลายฤทธิ์ของทองแดงเสียก่อน โดยการหาสารที่มีสมบัติช่วยจับโลหะมาใช้ เช่น diethyldithiocarbamate, cyanide azide และ EDTA เป็นต้น

ตารางที่ 2 ผลการเปรียบเทียบการทำปฏิกิริยาระหว่าง แคทีคอลเลส กับ แลคเคส

สารประกอบฟีนอลิค (Phenolic compound)

ในโลกของเรา เราพบสารประกอบฟีนอลิค หรือ สารประกอบฟีนอล มากมายมหาศาล ซึ่งพืชสามารถผลิตได้จากกระบวนการเมตาบอลิสม โดยทั่วไปแล้วสารประกอบฟีนอลจะมีโครงสร้างเป็นวงแหวนอะโรมาติกเบนซีน1วงขึ้นไป แล้วมีหมู่ไฮดรอกซิลอย่างน้อย1หมู่ ยึดติดกับวง นอกจากนั้นในสัตว์ชั้นสูงก็ยังสามารผลิตสารประกอบฟีนอลจากสารประกอบโซ่ตรงด้วยกลไกการสังเคราะห์ภายในเซลล์ ปัจจัยที่จะบอกว่ามีสารประกอบฟีนอลชนิดไหนบ้างนั้น อยู่ที่ปัจจัยหลายอย่าง เช่น สายพันธุ์, ความบริบูรณ์, สภาวะแวดล้อม และการเก็บรักษา ซึ่งสารประกอบฟีนอลที่พบในพืช ก็สามารถที่จะบอกได้ถึงคุณภาพในด้านสี, ความขม, รสชาดในพืชนั้นๆได้

ในผลไม้ เราจะพบสารประกอบฟีนอลในรูปฟลาโวนอยด์เสียเป็นส่วนใหญ่ นอกจากนั้นก็จะเป็นพวกแอนโทไซยานีน, ฟลาโวนอล และกรดซินนามิค ในตารางที่ 3 จะเป็นการแสดงสารประกอบฟีนอลบางส่วนที่พบผลไม้บางประเภท  สำหรับสารประกอบแอนโทไซยานิน และ ฟลาโวนอยด์ เป็นสารสีตามธรรมชาติ สารประกอบฟีนอลบางชนิดเช่น ไทโรซิน ก็จัดเป็นหนึ่งในกรดอะมิโน เนื่องจากโครงสร้างมีหมู่อะมิโน และสารประกอบหลายชนิดมีฤทธิ์ทางเภสัช เช่น กรดไฮยารูโลนิค

รูปที่ 9 โครงสร้างทางเคมีของสารประกอบฟีนอลที่พบในพืช(1)

รูปที่ 10 โครงสร้างทางเคมีของสารประกอบฟีนอลที่พบในพืช(2)

รูปที่ 11 โครงสร้างทางเคมีของสารประกอบฟีนอลที่พบในพืช(3)

รูปที่ 12 โครงสร้างทางเคมีของสารประกอบฟีนอลที่พบในพืช(4)

ตารางที่ 3 แสดงสารประกอบฟีนอลที่พบในวัตถุดิบ

ในตอนต่อไปเรามาดูวิธีในการยับยั้ง ชะลอ หรือ กำจัดเอนไซม์ในกลุ่มของโพลีฟีนอลออกซิเดสกันนะครับ